Cột ái lực miễn dịch (IAC)

Cột ái lực miễn dịch (IAC) là gì?

Cột ái lực miễn dịch (IAC) là loại cột được dùng trong kỹ thuật sắc ký lỏng (LC). Với pha tĩnh bao gồm kháng thể hay thuốc thử liên quan tới kháng thể. Trong đó, vật liệu hấp phụ sinh học được dùng để tạo liên kết chọn lọc với chất phân tích mong muốn. Sự chọn lọc và liên kết mạnh mẽ mà kháng thể tạo ra với chất phân tích khiến IAC có độ đặc hiệu cao và được quan tâm trong suốt thời gian.

Cấu trúc và tính chất của kháng nguyên và kháng thể

Cơ chế cơ bản của cột ái lực miễn dịch dựa trên khả năng tạo liên kết chọn lọc của kháng thể. Chúng là kết quả của nhiều tương tác không cộng hóa trị giữa kháng thể và kháng nguyên (hằng số cân bằng liên kết khoảng 10^5 – 10^12 M-1). Người ta ước tính cơ thể con người có thể tạo ra từ 10^7 đến 10^8 loại kháng thể khác nhau. Mỗi loại này lại có khả năng liên kết với 1 kháng nguyên riêng biệt. Lấy IgG là ví dụ, chúng bao gồm 4 chuỗi polypeptide. Bốn chuỗi này gồm 2 cặp chuỗi có khối lượng nặng và nhẹ bằng nhau, liên kết bằng liên kết disulfide tạo hình chữ Y. Vùng dưới của kháng thể gọi là Fc, được bảo vệ chặt chẽ từ lớp kháng thể này đến lớp kháng thể khác. Vùng trên của kháng thể được gọi là Fab. Trong 1 loại kháng thể đơn lẻ, trình tự acid amine là giống nhau. Ngược lại, với các kháng thể khác nhau, trình tự này rất khác biệt. Chính sự biến đổi trình tự acid amine này cho phép kháng thể liên kết được với nhiều loại kháng nguyên.

Hình 1. Cấu trúc cơ bản của kháng thể IgG

Kháng nguyên khi xâm nhập cơ thể người, động vật sẽ khiến cơ thể bắt đầu sản sinh kháng thể.

Các kháng nguyên thông thường bao gồm: virus, vi khuẩn và protein ngoại lai từ động vật và thực vật, có khả năng tạo phản ứng miễn dịch. Do kháng nguyên tự nhiên thường có kích thước lớn, sẽ tạo liên kết ái lực ở với kháng thể các vùng khác nhau. Mỗi vị trí liên kết trên kháng nguyên của kháng thể được gọi là epitope. Các tác nhân được hệ thống miễn dịch nhận biết và bắt đầu sản sinh kháng thể, chúng phải có khối lượng vài nghìn Dalton. Các kháng thể vẫn có thể được tạo ra nhằm chống lại các tác nhân nhỏ hơn. Trước hết, các tác nhân lạ phải liên kết với đơn vị lớn hơn chúng (ví dụ chất mang). Khi chúng tạo liên kết với kháng thể sẽ được gọi là hapten.

Điều kiện rửa giải của cột ái lực miễn dịch (IAC)

Khi thiết kế thí nghiệm với cột ái lực miễn dịch, điều kiện rửa giải là yếu tố quan trọng cần xem xét. Dung dịch đệm thường được dùng trong cột ái lực miễn dịch (IAC) nhờ vào khả năng thúc đẩy gắn kết hiệu quả giữa chất phân tích với kháng thể. Liên kết tối ưu của kháng thể thường xảy ra trong các điều kiện sinh lý. Do đó, cột ái lực miễn dịch (IAC) thường dùng dung dịch đệm pH trung tính (pH 7,0 – 7,4). Trong điều kiện này, hằng số cân bằng của liên kết kháng thể - kháng nguyên nằm trong khoảng 10^6 – 10^12 M-1. Đây là liên kết bền chặt, do đó việc rửa giải đẳng dòng thường không hiệu quả. Trừ khi vật liệu hấp phụ trong cột IAC là các kháng thể có ái lực thấp (hằng số cân bằng liên kết < 10^6 M-1)

Điều kiện rửa giải cho cột ái lực miễn dịch (IAC) cần đạt yêu cầu rửa giải nhanh. Nhưng vẫn cho phép tái tạo lại kháng thể. Đặc biệt với lượng mẫu lớn, cần rửa giải nhanh nhưng khả năng liên kết và tái tạo kháng thể cần được quan tâm. Rửa giải được thực hiện bằng cách giảm độ mạnh liên kết của chất phân tích và kháng thể. Cơ chế rửa giải thường gặp trong cột ái lực miễn dịch (IAC) bao gồm thay đổi pH pha động hoặc thêm vào tác nhân chaotropic vào pha động. Ngoài ra, một số cơ chế rửa giải cột ái lực miễn dịch khác bao gồm thêm vào tác nhân cạnh tranh, điều chỉnh môi trường hữu cơ, tác nhân biến tính vào pha động hay thay đổi nhiệt độ cột IAC.

Hình 2. Quy trình hấp phụ và rửa giải trong cột ái lực miễn dịch (IAC)

Thay đổi pH pha động

Đây là phương pháp phổ biến nhất để rửa giải hợp chất ra khỏi cột ái lực miễn dịch (IAC). Với phương pháp này, đệm thường dùng là đệm acid (pH 1-3). Rửa giải trong điều kiện kiềm cũng được sử dụng với trường hợp cột IAC hiệu năng thấp có chất hỗ trợ khác. Tuy nhiên, không thể dùng điều kiện kiềm với cột HPIAC có chất hỗ trợ, ví dụ như silica hoặc hạt thủy tinh, do chất hỗ trợ không ổn định và pH lớn hơn 8,0. Khó khăn khi thay đổi pH pha động là khiến kháng thể bị biến tính hoặc chất có ái lực cao không rửa giải khiến pH thay đổi. Tuy nhiên, nhiều loại cột ái lực miễn dịch (IAC) khá ổn định khi rửa giải có sự thay đổi vừa phải của pH (từ 7,0 – 7,5 đến 2,5 – 3,0).

Để tránh gây biến tính kháng thể khi pH giảm, rửa giải có thể thực hiện bằng cách thêm tác nhân chaotropic vào dung dịch đệm, ví dụ như thiocyanate (SCN-), trifluoroacetate (CF3COO-), perchlorate (ClO4-), iodide (I-) hoặc chloride (Cl-). Thứ tự rửa giải của các tác nhân này lần lượt là SCN- > CF3COO- > ClO4- > I- > Cl-. Các tác nhân trên được chứng minh ở nồng độ 1,5 – 8 M cho hiệu quả phân ly kháng nguyên – kháng thể cao nhất.

Khi dùng tác nhân điều chỉnh môi trường hữu cơ, cần xem xét nồng độ để không làm kháng thể biến tính vĩnh viễn. Khi dùng methanol hoặc chất hữu cơ khác, dung lượng tải mẫu của cột IAC sẽ giảm. Kháng thể biến tính có thể trở lại ban đầu, nhưng quá trình tái tạo động học mất nhiều ngày. Trong một nghiên cứu, cột ái lực miễn dịch anticlenbuterol được tái tạo sau 20 lần rửa giải bằng 2 mL ethanol trong 80% nước. Tuy nhiên, hiệu năng cột giảm một nửa sau 20 lần thử nghiệm. Do đó, nếu dùng cột ái lực miễn dịch (IAC) trong các điều kiện rửa giải nghiêm ngặt, dung lượng cột IAC phải lớn hơn rất nhiều so với lượng thật mẫu phân tích cần đo hoặc phân lập.

Ứng dụng của cột ái lực miễn dịch (IAC) - Phần 2

Xem thêm các bài viết khác

hoặc  Liên hệ đặt câu hỏi để đội ngũ admin Thái Dương chia sẻ thêm kiến thức