Pha tĩnh C18 - Loại pha tĩnh phổ biến nhất trong HPLC pha đảo

Pha tĩnh C18 là gì

Pha tĩnh C18 là loại vật liệu phổ biến được dùng trong phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha tĩnh C18 là octyldecylsilane mạch 18 carbon liên kết với silica. Nó có thể được dùng trong khoa học môi trường và hóa học phân tích. Ngoài ra, một số lĩnh vực khác mà pha tĩnh C18 có thể ứng dụng là dược phẩm, thực phẩm và các ngành công nghiệp khác. 

Không thể phủ nhận pha tĩnh C18 là một vật liệu được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực phân tích hiện nay. Để tìm hiểu sâu hơn về vật liệu này, chúng ta cùng tìm hiểu về những kiến thức cơ bản liên quan đến chúng.

Nguồn gốc ra đời

Ban đầu, Mikhail Tsvet, một nhà thực vật học người Nga đã thử cô lập và phân tách các sắc tố tự nhiên (cartenoid, chlorophyll,…) từ các mô thực vật. Trong thí nghiệm, ông dùng pha tĩnh là vật liệu từ thiên nhiên – khoáng chất và muối đá (muối calcium) và pha động là ethanol. Tsvett đã đặt tên cho kỹ thuật này là “Sắc ký”, một nhánh quan trọng của hóa học phân tích. Trong đó, “sắc” chính là màu sắc từ các loài thực vật và “ký” là sự ghi nhận được. Ngày nay, vật liệu pha tĩnh càng ngày được phát triển và hoàn thiện. Nổi bật nhất trong đó phải kể đến hạt silica liên kết ligand C18 có độ xốp cao, hình cầu và kích thước đồng nhất được đóng gói trong ống thép không gỉ.

Hydrocarbon là một ví dụ hoàn hảo cho loại pha tĩnh kị nước. Cụ thể hơn là các alkane mạch thẳng rất thích hợp để dùng trong pha tĩnh. Khi số carbon tăng lên, tính chất vật lý của hydrocarbon sẽ thay đổi. Ví dụ như từ C1 – C4 là thể khí, C5 – C17 là thể lỏng và từ C18 trở lên sẽ ở thể rắn. Ngoài mạch thẳng, các loại vật liệu khác như alkane thơm hoặc mạch vòng cũng được dùng để làm pha tĩnh. Sự phổ biến của pha tĩnh C18 có thể do được phát hiện sớm trong giai đoạn đầu tìm vật liệu liên kết. Nhờ đó, những nghiên cứu xa hơn về khả năng tương thích của C18 trong quá trình sắc ký được thực hiện. Cả 2 yếu tố trên đã khiến pha tĩnh C18 trở thành vật liệu phổ biến nhất trong pha tĩnh – pha đảo (RP). 

Sử dụng các phản ứng được phát triển bởi John Speier tại Dow Corning, Hoa Kỳ, các nhà khoa học của tập đoàn Waters đã tổng hợp thành công octadecyldimethylchlorosilane (ODS). Từ đó, sự ra đời của pha tĩnh C18 liên kết đơn được thương mại lần đầu vào năm 1973. 

Cấu tạo pha tĩnh C18

Pha tĩnh C18 là octyldecylsilane mạch 18 carbon liên kết với silica. Hạt silica thường dùng có nhiều hình dạng khác nhau (hình cầu phổ biến hoặc hình dạng khác). Chúng có kích thước đa dạng (lên đến hơn 10 µm) và độ xốp (lớn tới 1000 Å). Pha tĩnh là C18 được gắn vào silica ở cấp độ phân tử và tạo liên kết vật lý. Pha tĩnh C18 có nhiều carbon và mạch carbon dài hơn C8 (8 carbon) hoặc C4 (4 carbon). Nhờ vào số carbon nhiều hơn, pha tĩnh C18 có diện tích bề mặt lớn hơn. Do đó, pha động cũng di chuyển nhiều hơn trong pha tĩnh C18. Điều này giúp tăng thời gian tương tác giữa pha tĩnh C18 và chất phân tích. Nhờ đó, mẫu được rửa giải chậm hơn và phân tách tốt hơn.

Trong nhiều năm qua, pha tĩnh C18 truyền thống gặp trở ngại liên quan đến việc dùng chất nền silica. Sự kết dính giữa ligand C18 lên bề mặt silica có thể bị thủy phân hóa ở pH < 2, dẫn đến hao hụt ligand trong khi các hạt silica lại dễ bị hòa tan ở pH > 8. Tuy nhiên, để cải thiện nhược điểm đó, một số loại pha tĩnh C18 trên thị trường đã được biến đổi. Ví dụ như 1 silane đa chức được tạo thành từ 1 dichloro- hoặc 1 dialkoxysilane liên kết hóa học với silica, sự kết cặp này được cho làm tăng độ ổn định của pha tĩnh C18 ở các giá trị pH thấp hơn và giảm sự chảy máu cột.

Hình 1. Các loại ligand pha tĩnh C18 đang được thương mại hóa (nguồn) 

Cơ chế lưu giữ của pha tĩnh C18 trong sắc ký pha đảo

Cơ chế lưu giữ của pha tĩnh C18 dựa trên tương tác kỵ nước. Khi chất phân tích theo dung môi pha động đi vào lỗ xốp của silica, chúng có thể bị hydrocarbon giữ lại bằng tương tác kỵ nước yếu (van der Waal).

Hình 2. Tương tác kỵ nước giữa pha tĩnh C18 và chất phân tích (nguồn)

Một thông số quan trọng đại diện cho tính kỵ nước của hợp chất là log P. Giá trị này là hằng số cân bằng của hợp chất sau khi chúng được cho vào hỗn hợp nước – n-octanol. Khi log P dương, hợp chất dễ hòa hơn tan trong n-octanol và có tính kỵ nước hơn. Ngược lại, khi log P âm, hợp chất dễ hòa tan hơn trong nước và có tính ưu nước hơn.

Hình 3. Giá trị log P của các hợp chất khác nhau  (nguồn)

Dựa trên giá trị này có thể kết luận, chất phân tích lưu giữ trong pha tĩnh C18 sẽ có tính trung tính hoặc kỵ nước. Đối với các chất trung hòa hoặc không tích điện, ta không thể thay đổi tính chất của chúng. Tuy nhiên, với chất có tính acid và bazơ yếu, ta có thể dùng đệm để thay đổi trạng thái tích điện của chúng. Độ mạnh của acid hoặc bazơ được thể hiện bằng giá trị pKa (và pKb). Trong dung dịch, acid và bazơ yếu tồn tại ở 2 dạng: dạng trung tính và dạng deproton hóa (acid) hoặc proton hóa (bazơ) của chúng. Ở 1 giá trị pH cụ thể, 2 dạng liên hợp này có nồng độ bằng nhau. Giá trị pH này được gọi là pKa và pKb. 

Hình 4. Minh họa giá trị pK và mối quan hệ của chúng với sự tăng hoặc giảm tính kỵ nước của các hợp chất  (nguồn)

Trong thực tế, giá trị pH của pha động thường lần lượt lớn hoặc nhỏ hơn 2 đơn vị so với giá trị pKb hoặc pKa tương ứng. Lúc này, pH của pha động sẽ đảm bảo khả năng lưu giữ của chất phân tích trên pha tĩnh C18 là tốt nhất. Tuy nhiên, vẫn có những trường hợp ngoại lệ. 

Trong RP với pha tĩnh C18, một số dung môi pha động khác ngoài nước được sử dụng là methanol (MeOH), acetonitrile (CAN) và tetrahydrofuran (THF). Theo thứ tự độ mạnh, MeOH và THF lần lượt là dung môi rửa giải yếu nhất và mạnh nhất. Độ mạnh của dung môi tỉ lệ thuận với thời gian chất phân tích được rửa giải ra khỏi pha tĩnh C18. Tuy nhiên, đối với mẫu chứa hỗn hợp chất cần phân tích, độ mạnh dung môi không đồng nghĩa với độ chọn lọc.

Điểm giống nhau giữa pha tĩnh C18 và C8

Pha tĩnh C18 và C8 được tạo thành từ 2 loại nhóm chức alkyl mạch thẳng. Đây là một cách biến đổi bề mặt pha tĩnh silica trong sắc ký pha đảo HPLC.

Trong sắc ký pha thuận, silica là loại pha tĩnh phổ biến nhất. Tuy nhiên, chúng là pha tĩnh phân cực. Do đó, muốn sử dụng silica trong sắc ký pha đảo ta cần biến đổi bề mặt của chúng. Khi gắn thêm các dây alkyl dài 18 carbon hoặc 8 carbon ta lần lượt thu được pha tĩnh C18 hoặc C8.

Với pha tĩnh C18 hoặc C8, dung môi pha động sẽ chứa nước với độ phân cực vừa phải.

Pha tĩnh C18 hoặc C8 có kích thước hạt gần như bằng nhau. Đồng thời pha tĩnh C18 hoặc C8 đều được endcap.

Do pha tĩnh C18 và C8 đều là pha tĩnh ít phân cực, chúng có khả năng lưu giữ các hợp chất không phân cực cao hơn.

Điểm khác nhau giữa pha tĩnh C18 và C8

Có thể thay pha tĩnh C8 bằng pha tĩnh C18 được hay không?

Từ những thông tin so sánh về điểm giống và khác nhau giữa 2 loại pha tĩnh, ta có thể kết luận rằng pha tĩnh C18 và C8 là gần giống nhau (khi dùng trong sắc ký pha đảo). Tuy nhiên, pha tĩnh C18 có khả năng lưu giữ cao hơn và LOQ thấp hơn. Do đó, ta có thể sử dụng pha tĩnh C18 thay thế cho C8 (đặc biệt là các hợp chất kỵ nước) nếu như:

1. Nền mẫu không gây nhiễu

2. Thay đổi chế độ rửa giải phù hợp với sự chuyển đổi này

Hình 5. Sắc ký đồ của các hợp chất khác nhau phân tách lần lượt bằng pha tĩnh C18 và pha tĩnh C8

(https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/technical-article/analytical-chemistry/large-molecule-hplc/discovery-c18-c8-hplc-columns)

Bài viết khác có thể bạn quan tâm:

https://thaiduong-solution.vn/tin-tuc/vat-lieu-silica-gel-bien-tinh.html

https://thaiduong-solution.vn/tin-tuc/huong-dan-chon-cot-hplc.html

CÔNG TY TNHH GIẢI PHÁP THIẾT BỊ THÁI DƯƠNG

https://thaiduong-solution.vn/

 Địa chỉ: 210/12 Cách Mạng Tháng Tám, Phường 10, Quận 3, TP HCM

 Tel: 0985 554 054