1. Kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPE) là gì ?
Vi chiết pha rắn SPE là phương pháp xử lý mẫu mà trong đó các hợp chất hòa tan hoặc rắn lơ lửng trong dung dịch được tách ra khỏi mẫu nhờ vào tính chất vật lý hoặc hóa học của chúng. Vi chiết pha rắn được thiết kế để xử lý mẫu nhanh chóng trước khi mẫu tinh được đưa vào hệ sắc ký. Vi chiết pha rắn SPE là một bước xử lý mẫu quan trọng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm.
Hình 1. Ảnh chụp dụng cụ Vi chiết pha rắn SPE
Khi mẫu được bơm nhỏ giọt qua Vi chiết pha rắn SPE catridge hoặc dạng đĩa, chất phân tích hoặc một số hợp chất khác có trong nền mẫu có thể bị giữ lại trên vật liệu SPE. Tùy thuộc vào tính chất của chất phân tích hay vật liệu hấp phụ SPE mà sẽ chọn loại dung môi rửa giải (loại bỏ) một cách có chọn lọc các chất được hấp phụ. Mục đích của SPE nhằm loại bỏ yếu tố gây nhiễu trong nền mẫu và giữ lại chất phân tích ban đầu.
Để đạt được mục đích trên, một số kỹ thuật vi chiết pha rắn SPE cho thể kể đến bao gồm:
1.1 Cơ chế liên kết và rửa giải:
Chất phân tích được giữ lại còn thành phần nền sẽ đi ra ngoài. Sau đó, chất phân tích được rửa giải ra khỏi SPE bằng dung môi mạnh.
1.2 Cơ chế loại bỏ/bẫy tạp chất:
Chất phân tích không hấp phụ mà đi thẳng ra ngoài còn thành phần gây nhiễu bị giữ lại.
Hình 2. Cơ chế liên kết và rửa giải trên SPE (A) trong đó chất phân tích được giữ lại trên vật liệu hấp phụ, chất gây nhiễu đi ra. Sau đó chất phân tích được rửa giải (c);
Cơ chế loại bỏ/bẫy tạp chất (B) trong đó chất phân tích không hấp phụ mà được rửa giải, chất gây nhiễu hấp phụ bị giữ lại.
2. Ứng dụng của kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPE)
2.1 Loại bỏ chất gây nhiễu đến từ nền mẫu
• Tinh sạch thành phần chất phân tích (có tính chọn lọc)
• Cải thiện tuổi thọ cột. Bởi việc loại bớt tạp chất trong nền mẫu. SPE giúp cột sạch và hạn chế chảy máu cột.
• Tăng tuổi thọ thiết bị: Không chỉ có cột phân tích, hệ thống bơm, đường dẫn, đầu dò.... đều bị ảnh hưởng bởi nền mẫu. Việc tạo ra 1 mẫu "sạch" giúp bảo vệ hệ thống sắc ký, quang phổ của bạn.
• Giảm sự triệt tiêu ion trong các ứng dụng khối phổ
2.2 Làm giàu mẫu
• Cải thiện độ nhạy (LLQQ thấp hơn). Nhiều chi tiêu phân tích cần giới hạn phát hiện cực thấp mà máy không đạt được, phương pháp
vi chiết pha rắn (SPE) giúp làm giàu mẫu lên 100, 1000 lần.... giúp cho máy tăng độ nhạy.
• Cải thiện độ tái lặp (% độ chính xác và % RSD)
2.3 Xử lý mẫu dùng cho phân tách và xác định thành phần
• Khả năng tương thích giữa dung môi và pha động
• Kết quả sắc ký đồ tốt hơn (cải thiện hình dạng peak)
3. Phân loại kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPE)
SPE được phân thành nhiều loại khác nhau bao gồm pha đảo, pha thuận, trao đổi ion (anion/cation) và hỗn hợp các pha.
Hình 3. Các loại kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPE) và cơ chế của chúng
3.1 Hấp phụ (pha đảo)
Kỹ thuật SPE pha đảo được tối ưu để dùng cho các chất phân tích có độ phân cực trung bình đến thấp. SPE phân tách các chất phân tách dựa trên tính kỵ nước và các chất phân cực sẽ được rửa giải trước. Do sự đa dạng các chất phân tích trong mẫu chất lỏng (ví dụ như mẫu nước thải, nước tiểu và huyết tương), SPE hấp phụ (pha đảo) thường được sử dụng.
Bạn có thể thấy cụ thể trong hình ảnh mô tả sau:
Hình 4. Màu thuốc nhuộm đỏ và xanh trong mẫu Kool-Aid được phân tách bằng SPE pha đảo
Quy trình phân tách màu đỏ và xanh trong mẫu Kool-Aid màu tím ban đầu có thể hiển thị ở hình 4. Dung dịch ban đầu được tải vào SPE với vật liệu hấp phụ pha đảo đã được cân bằng trước bằng nước. Thành phần tẩy rửa đầu tiên chủ yếu là nước và các hợp chất có mức độ phân cực cao, thuốc trục sẽ được giữ lại trong vật liệu hấp phụ. Tiếp tục tăng dần nồng độ dung dịch môi trường isopropyl alcohol (IPA) Tẩy giải hết những chất không phân cần thiết còn lại trong mẫu.
3.2 Hấp phụ (pha thuận)
Kỹ thuật SPE pha thuận thường được dùng với các chất phân tích có độ phân cực từ thấp đến cao hay trung tính. Cartridge chứa vật liệu hấp phụ phân cực, ví dụ như silica. Quá trình phân tách diễn ra dựa trên độ phân cực, chất có độ phân cực càng thấp sẽ rửa giải càng nhanh. Mẫu sử dụng trong SPE pha thuận thường không chứa nước.
Ví dụ, khi ta muốn xác định nồng độ polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) trong mẫu cà phê. Do nhiều PAH là chất gây ung thư và được đưa vào trong quá trình rang cà phê. Hạt cà phê sẽ được nghiền nhỏ, hòa tan và tách dầu thừa bằng dung môi 1-pentane. Mẫu được chiết ngoài PAH còn chứa các chất nhiễu khác. Tiếp theo, SPE được dùng để tinh sạch/ hoặc làm giàu mẫu PAH. Quá trình tinh sạch diễn ra theo cơ chế liên kết và rửa giải (Hình 2A). Một chất PAH, ví dụ như benzo(k)fluoranthene (Hình 5) được hoà tan trong pha dung môi 1-pentane và electron π của chúng sẽ tương tác với nhóm chức phân cực trong pha hấp phụ. Khi mẫu được nạp vào SPE cartridge, PAH sẽ được giữ lại ở pha tĩnh. Sau đó, thay đổi dung môi và PAH được rửa giải ra ngoài.
Hình 5. Cấu trúc hóa học của PAH benzo(k)fluoranthene
3.3 Trao đổi ion (cation/anion)
Kỹ thuật SPE trao đổi ion cho phép phân tách thành phần chất phân tích dựa vào điện tích của chúng. Ví dụ như phân tách thành phần 4-aminophenol và acetaminophen. Trong môi trường pH acid, 4-aminophenol chứa nhóm chức -NH2 và tích điện dương, acetaminophen không tích điện. Dựa trên sự khác biệt này, cách tốt nhất để phân tách chúng là sử dụng SPE trao đổi ion.
Có 2 loại SPE trao đổi ion đó là trao đổi cation và trao đổi anion. Khi thành phần muốn giữ lại tích điện dương, ta sẽ dùng trao đổi cation. Quá trình phân tách diễn ra gồm 3 bước cơ bản trên SPE (Hình 2A). Khi bơm mẫu vào cartridge, cartridge trao đổi cation sẽ giữ lại 4-aminophenol tích điện dương nhờ vào tương tác tĩnh điện. Chất được rửa giải trước sẽ bao gồm thành phần tích điện âm và trung tính như acetaminophen. Để rửa giải 4-aminophenol ra khỏi cartridge, ta chỉ cần dùng dung môi có độ mạnh ion cao hơn. Lượng lớn ion tích điện dương trong dung môi sẽ cạnh tranh liên kết với chất nền, nhờ đó 4-aminophenol được rửa giải ra ngoài.
Hình 6. Quá trình rửa giải 2 chất phân tích trong SPE trao đổi ion
Kỹ thuật SPE hỗn hợp các pha là sự kết hợp giữa trao đổi ion và SPE pha đảo nhằm tăng khả năng phân tách. Một số ví dụ cho sự kết hợp các pha SPE bao gồm:
Pha đảo/ trao đổi cation mạnh
Pha đảo/ trao đổi anion mạnh
Pha đảo/ trao đổi cation yếu
Pha đảo/ trao đổi anion yếu
Thành phần trao đổi ion trong cartridge giúp giữ lại các chất tích điện. Sau khi các hợp chất tích điện đã được giữ lại, SPE có thể rửa giải bất kì thành phần tạp chất nào. Độ pH của dung dịch rửa giải sẽ được điều chỉnh nhằm giảm điện tích trên các phân tử của chất phân tích và sau đó chúng được rửa giải khỏi cartridge. Kỹ thuật SPE hỗn hợp các pha cũng hoạt động theo cơ chế pha đảo. Do đó, khi thay đổi nồng độ dung môi rửa giải sẽ giúp cải thiện độ chọn lọc của quá trình phân tách.
Kỹ thuật SPE hỗn hợp các pha thường được dùng trong chiết tách các hợp chất bazơ, acid và trung tính. Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong việc làm giàu mẫu, tinh chế và phân tích các hợp chất dược phẩm và chất kháng khuẩn có trong mẫu nước thải.
| Chế độ | Vật liệu hấp phụ | Cơ chế lưu giữ | Nền mẫu | Tính chất của chất phân tích | Quy trình rửa giải | Ứng dụng |
| Pha đảo | Không phân cực | Tương tác không phân cực hoặc kỵ nước | Mẫu lỏng | Thể hiện tính không phân cực | · Phá vỡ tương tác pha đảo với dung môi hoặc hỗn hợp dung môi không phân cực | · Thuốc hoặc chất chuyển hóa trong dịch sinh học |
| C2 | Dịch sinh học | Hầu hết các chất hữu cơ | · Methanol, acetonitrile, dichloromethane | · Các chất gây ô nhiễm môi trường nước | ||
| C8 | Chiết xuất từ mẫu lỏng | Nhóm chức ankyl, thơm, mạch hở | · Dung dịch đệm/ hỗn hợp dung môi | · Dịch lỏng chiết từ mô tế bào hoặc chất rắn | ||
| C18 | Mẫu nước trong môi trường | |||||
| Phenyl | Rượu hoặc bia | |||||
| Pha thuận | Phân cực | Tương tác phân cực | Không phân cực | Thể hiện tính phân cực | Tương tác phân cực bị phá vỡ bởi dung môi hoặc dung dịch phân cực hơn | · Làm sạch chiết xuất hữu cơ từ mẫu đất và bùn |
| Alumina | · Liên kết hydro | · Chiết xuất hữu cơ từ chất rắn | · Hydroxyl, carbonyl amine, liên kết đôi | · Acetonitrile, methanol, isopropanol | · Phân đoạn hydrocarbon dầu mỏ | |
| Silica (Si-OH) | · pi-pi | · Dung môi có độ không phân cực cao | · Dị nguyên tử (O,N,S,P) | · Kết hợp dung môi/hỗn hợp dung môi | · Polychlorinated biphenyl (PCB) trong dầu cách điện máy biến áp | |
| Diol | · Lưỡng cực -lưỡng cực | · Dầu béo, hydrocarbon | · Cộng hưởng | · Phân lập các thành phần trong mỹ phẩm | ||
| Cyano | · Lưỡng cực cảm ứng | |||||
| Amino | ||||||
| Florisil | ||||||
| Trao đổi ion | Amine bậc 4 (anion) | Tương tác tĩnh điện giữa nhóm chức tích điện của chất phân tích và nhóm chức tích điện trái dấu trên chất hấp phụ | Dung dịch hoặc dung môi hữu cơ có nồng độ muối thấp (<0,1M) | Trao đổi cation – dùng cho hợp chất bazơ như amine | Phá vỡ tương tác tĩnh điện thông qua: | · Các hợp chất dược phẩm và thuốc trong dịch sinh học |
| Acid sulfonic (cation) | · Dịch sinh học | Trao đổi anion – dùng cho hợp chất acid | Điều chỉnh pH nhằm trung hòa nhóm chức của hợp chất và/ hoặc chất hấp phụ | · Loại bỏ acid béo ra khỏi mẫu thực phẩm hay nông nghiệp | ||
| · Phản ứng tổng hợp pha lỏng | Tăng nồng độ muối (>1M); hoặc sử dụng ion khác cạnh tranh chọn lọc các vị trí liên kết trao đổi ion | · Acid hữu cơ trong nước tiểu | ||||
| · Thuốc diệt cỏ trong đất |
